Mикробиологический мониторинг

[FAVEA, Яна Гаклова (Jana Haklová), доктор наук]

Мониторинг, как и валидация, является неотъемлемой частью GMP и производства лекарств. Современное обеспечение качества не считает достаточным проведение одной лишь проверки готового продукта на стерильность или микробную загрязненность, и уделяет особое внимание максимальному ограничению риска контаминации во всем производственном процессе. Выявление возможного загрязнения является целью проведения микробиологического мониторинга. Проводится данный вид мониторинга как в чистых помещениях, так и в контролируемых зонах на производстве и в лабораториях.

Особенно важен мониторинг среды при производстве стерильных лекарств, в частности, препаратов, производимых в асептических условиях (когда лекарственное средство по ряду причин невозможно подвергнуть стерилизации в упаковке). Проводится мониторирование всех критических факторов, которые могут быть источником микробиологической контаминации продукта – водных систем, чистых помещений и контролируемых зон, стерилизации, непосредственно производства, очистки и дезинфекции.

Требования нормативной документации к проведению мониторинга исходят из документов GMP или норм ISO.

Требования GMP:

  • EU Guide — Sterile Drug Products, Anex 1, Revised in 2009 (в Чехии VYR-32)
  • FDA Guideline on Aseptic Processing 1987, Revised 2004
  • USP <1116> Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments
  • PDA Technical Report Nr.13, Fundamentals of an Environmental Monitoring Program

Требования ISO:

  • ISO 1348 — 1 Aseptic Processing of Health Care Product
  • ISO 14644 — 1 Cleanrooms and associated controlled environments
  • ISO 14698 – Cleanrooms and associated controlled environments
  • Biocontamination сontrol

Данные документы описывают чистые помещения, выполняемую в них работу, а также содержат рекомендации по составлению планов мониторинга, периодичности и размещению точек пробоотбора, используемых методик. Некоторые документы содержат рекомендации по установлению лимитов для отдельных классов чистоты.

Нормативные требования по производству и мониторингу нестерильных лекарств затем не так строги, как в случае стерильных лекарств. Существует ряд рекомендаций по мониторированию помещений для производства нестерильных препаратов и лекарственных веществ (особенно тех, которые будут использованы в последующем в производстве стерильной продукции). Допустимые значения и периодичность мониторинга исходят из требований к производству стерильных препаратов.

Микробная контаминации и ее источники:

В неконтролируемых помещениях находится большое количество микроорганизмов. Общее количество и виды микробов зависят от множества факторов, включая географические и климатические условия (температура, влажность, присутствие живых объектов растительного и животного происхождения). Как и биосфера, микроклимат фармацевтического производства является потенциальной средой для появления и размножения микроорганизмов. В сферу интересов фармацевтической микробиологии входят бактерии и грибы.

Воздух является относительно неблагоприятной средой, поскольку не содержит необходимого количества воды. Преимущественно в воздухе присутствуют спорообразующие бактерии, грибы. В воздухе микроорганизмы передвигаются, прикрепляясь к частицам, поэтому существует корреляция между содержанием в воздухе частиц и бактерий.

Вода является наиболее обжитой частью биосферы, где присутствует большое количество видов микроорганизмов. 90% микроорганизмов, содержащихся в неочищенной воде, являются G-бактериями. G-бактерии воды являются основным источником пирогенных эндотоксинов.

Персонал является наиболее частым источником контаминации в чистых помещениях. С учетом способа производства, возможность контаминации нестерильных лекарственных форм выше, чем стерильных. Известно, что контаминация парентеральных препаратов может иметь фатальные последствия для пациента. Наиболее частыми источниками обнаруживаемых микроорганизмов являются: естественная микрофлора кожи, дыхательные пути, биологические жидкости, содержимое кишечника, открытые раны.

Сырье содержит микроорганизмы, характер которых зависит от природы, условий хранения и переработки сырья. Сырье природного происхождения часто содержит микроорганизмы и поддерживает их рост. Сырье химического происхождения, как правило, контаминируется в меньшей степени, однако может произойти вторичная контаминация от упаковочных материалов и окружающей среды.

Чистые помещения

Целью чистого помещения является защита продукта от контаминации производственного помещения. Прежде всего, производство стерильных препаратов должно проводиться в чистых помещениях, оборудование кондиционирования которых обеспечит защиту критических операций. Наиболее строгие требования предъявляются в отношении чистых помещений для асептического производства.

Основные требования к организации чистых помещений:

  • Строительное решение должно обеспечить легкость уборки.
  • Воздух должен поступать в помещения через HEPA фильтры. Кратность воздухообмена регламентируется.
  • Вход в помещения должен быть позволен только работающему в них персоналу, прошедшему обучение.
  • Для работы в чистых помещениях используется защитная спецодежда.
  • Материал, поступающий в чистые помещения, должен тщательно деконтаминироваться.
  • Рабочие процедуры и методы должны валидироваться, периодически актуализироваться и проверяться.

Допустимые пределы микробного загрязнения

Класс чистоты согласно требованиям ЕС определяется количеством частиц и микроорганизмов в 1 м³ воздуха. Несмотря на то, что пределы содержания частиц в оснащенном и эксплуатируемом состояниях различны, микробиологические пределы установлены только для эксплуатируемого состояния. Микробиологический мониторинг в оснащенном состоянии может проводиться в рамках валидации чистых помещений.

Рекомендуемые пределы микробиологической контаминации

Класс В воздухе, КОЕ*/м3 Cедиментационное осаждение на пластину Ø90 мм КОЕ/4 часа Контактные пластины Ø55 mm КОЕ/пластина Отпечаток 5 пальцев в перчатке КОЕ/перчатка
A <1 <1 <1 <1
B 10 5 5 5
C 100 50 25
D 200 100 50

*КОЕ = колониеобразующая единица

Используются 2 вида лимитов — тревоги и действия.

Лимит действия (ЛД) — значение, превышение которого должно вызвать незамедлительную ответную реакцию.

Лимит тревоги (ЛТ) — значение, предупреждающее о том, что результат в данной точке хуже обычного и может достичь лимита действия.

На новых производствах в качестве ЛД используются лимиты рекомендованные, ЛТ вначале не используются. Затем фирма устанавливает свои собственные лимиты, рассчитанные на основе полученных результатов. Поскольку ЛТ мало отличается от ЛД (при низких значениях КОЕ), то для микробиологического мониторинга не используется.

Программа мониторинга

Основной микробиологический мониторинг включает отслеживание:

  • Контаминации воздуха – активным методом (при помощи прибора) и пассивным (седиментационные пластины).
  • Контаминации поверхностей – метод отпечатков на агаровую среду, метод взятия мазков с поверхности
  • Контаминации работников — метод отпечатков на агаровые пластины

Во всех случаях речь идет о культивационных методах на агаровой среде с подсчетом количества колоний.

На асептических производствах также контролируется:

  • стерильность первичной упаковки
  • микробиологическая нагрузка инъекционного препарата перед фильтрацией — Bioburden
  • cтерильность дезсредств, использованных для последней санитации
  • эффективность методов стерилизации — область контроля, входящая в валидацию.

Отслеживание содержания микроорганизмов и эндотоксинов в фармацевтической воде является неотъемлемой частью мониторинга. В связи с обширностью вопроса ему будет посвящена отдельная статья.

Программа мониторинга должна иметь статус обязательного к исполнению документа и содержать следующую информацию:

  • описание помещений, точек пробоотбора, план размещения точек или их фотографии
  • установление критических точек (открытый продукт, частое вмешательство оператора и т.д.)
  • периодичность пробоотбора и время взятия проб
  • ссылки на методики — пробоотбора, инкубации, оценки результатов
  • установление ответственности за определенные операции
  • установление ЛТ и ЛД
  • описание мер, которые должны быть приняты при превышении лимитов

Оценка результатов

Для оценки результатов мониторинга имеют значение как комплекты данных по отдельным сериям, так и длительное отслеживание отдельных параметров — трендов.

При оценке результатов по отдельным сериям выявленное количество КОЕ сравнивается с предельными значениями. В случае превышения обнаруженные микроорганизмы идентифицируются. Целью идентификации является установление вероятной причины контаминации. В зависимости от обнаруженного микроорганизма делается вывод о возможном источнике загрязнения — вода, воздух, персонал, сырье и т.д.

Расследование

При превышении ЛД должна следовать незамедлительная реакция и расследование. Расследование превышения ЛТ в основном производится в случае двух и более последовательно возникших эпизодов. Микробиолог при сотрудничестве с ответственными работниками производства и обеспечения качества должны тщательно оценить полученные данные с точки зрения возможного риска для пациента. Необходимо каждый случай оценивать индивидуально.

Необходимо установить характер проблемы (например, высокое количество микроорганизмов в критической зоне, или небольшое превышение лимитов, но с большего количества типов пробоотбора), характер процесса (продукт асептически наполняемый / температурно стерилизуемый), характер продукта (консервированный / склонный к контаминации / имеет противомикробные свойства), характер контаминации (спорообразующие микроорганизмы, устойчивые к дезинфекции / неустойчивые микроорганизмы).

Диапазон мер по результатам расследования может включать повышение внимательности при проведении уборки и санитации вплоть до переподготовки персонала и забраковки серии.